心脏瓣膜的冻干实验是在一种实验型快速冻干仪器中进行的，其结构如图5-23所示。
将冷阱浸在硅树脂油的冷浴中冷却到-70℃，用旋片泵维持真空度，用麦氏计来测量真空度，可以达到0.005mmHg。
三个瓣膜叶片用一种单纤维尼龙丝系在一小块PVC塑料网上，装在一个Falcon塑料管中。大多数实验中，Falcon塑料管浸在液氨或控制了温度的硅树脂油中，瓣膜叶片在冷空气环境下冷冻。冷却Falcon塑料管的冷浴的温度为-15℃、-40℃、-80℃或者-196℃。然后，将Falcon塑料管从低温液体中取出，快速地放入冻干机的冻干箱里；少数实验中瓣膜叶片被直接浸入-60℃或者-80℃的酒精浴冷冻。样品的冻结速率数据列于表5-13中。在叶片角落里粘有一个与图表记录器相连接0.12mm的铜镍合金，用于测量温度。冻干室初始温度为室温22℃，然后通过浸在-20℃或-30℃的恒温浴里控制温度。之后，自然升温，此为非控制冻干。
真空干燥连续进行3h，这时叶片温度稳定在室温(22℃)。通过SEM对这些叶片的部分进行检查显示出预期的多孔结构，如图5-24所示。孔是由冷冻中形成和干燥中驱除的冰晶体产生的。而且有一个规律，冷却速度越低孔越大[对比图5-24(a)和(b)]，但不连续，每个样品也不一样[如图5-24(b)的例子]。叶片的厚度与冷却速度有直接联系。因为大多数孔的尺寸显得比预期的要小得多，可以尝试着在干燥前对叶片熔化和再冷冻，这样可以提高冰孔的尺寸。其他更多的叶片以6℃/min的速度冷却，在温度为37℃的水浴里熔化，然后以相同的速度再冷冻，三个以上再以72℃/min的速度冷却，但是它们产生了与仅仅经过一次冷冻的叶片相似的SEM外形。
另一个问题就是稠密层的出现，许多样品表面很显然没有孔[见图5-24(b)]；SEM图片显示叶片表面是压实的，内部孔和外部很少连通[见图5-24（c）]；在叶片物质内部同样出现了紧凑层[见图5-24(d)]。这些现象显示了在干燥过程中发生了广泛的坍塌，可能是在干燥过程中温升较快造成的。在处理结束，叶片的含水量很少，很可能是发生了熔化和蒸发，而不是升华。因此后面进行了严格的控制冷冻干燥实验。
在控制冷冻干燥过程中，选择了两种冷冻方法：将Falcon试管放在-40℃的冷浴里(平均冷却速度为6.7℃/min)，或者是放在196℃的液氮里（平均冷却速度为51℃/min)。将干燥烧瓶放在设定温度的冷浴里6h，它的温度就被控制在-20℃或-30℃；6h后关掉冷藏室，让浴温自动上升。测量的温升速度是0.06～0.08℃/min，从-20℃达到0℃需要5h，从-30℃到达0℃需要6.3h。总的真空干燥时间需要16h，最终温度为5～11℃。每个实验方案冻干了三个叶片，然后经过SEM检验。从8个瓣膜里得到的24个叶片都经过相同的处理，在干燥处理过程中或结束后和再水化后测量水的含量。结果显示在-30℃时的干燥速度是很慢的，20℃时尽管在那个阶段的最后将干燥时间从6h延长到12h可以保证水的含量很低，但是它对最后剩余水气没有影响。更多的研究是在为-20℃或-30℃温度下干燥6h的初始干燥后，再以0.06℃/min的加热速度进行第二次干燥，整个过程需要16h。
SEM照片（见图5-25）显示，-20℃干燥的叶片有更好的外观，多孔基体更统一，没有坍塌的区域和厚的、稠密的边界层。孔的尺度比非控制冷冻干燥的叶片看上去大很多[比较图5-24(a)和图5-24(b)与图5-25(a)和图5-25(b)]。冻结速率为7℃/min的叶片孔显得比50℃/min的叶片的孔稍大而且更均匀。-30℃干燥的叶片表面外壳更厚一些，显示了在第二个干燥阶段中已经发生了坍塌。这是由于在最初的温度为-30℃干燥6h后，有更高的水含量。所以，起初干燥的温度最好是-20℃。但是，在两种情况下，表面都缺乏明显的与内部多孔基体相连通的孔。
为了确定从SEM检查得到的压痕数量，测量了冻干叶片的厚度和孔的尺寸。图5-26显示了对两种冷却速度的数据比较，一种是非控制快速干燥，另一种是-20℃的控制干燥。不考虑干燥方法的影响，快速冷冻后叶片变得更厚了；同样，不考虑冷却速度的影响，控制干燥的叶片也更厚了。假如避免了崩塌，对于两种冷却速度，沿着垂线方向从内流到外流表面的冰孔数量相似。对分别经过1℃/min、5℃/min、25℃/min冷却速度的冷冻，然后进行初始干燥温度为-20℃的冷冻干燥的叶片，通过SEM测量了其孔的截面积的分布。在两个垂直方向上进行了表面观察，第一个是半径方向，即从容器表面指向容器中心；第二个指定的切线方向与第一个方向成90°，即它与容器表面的切线平
行。结果如图5-27所示。可以看出冷却速度(1℃/min)低，冻干样品冰孔尺度分布广，而且在断面的两个方向上没有显著的差别；冷却速度快则冻干样品冰孔尺度分布窄，而且切线方向上比半径方向上孔径更大，也就是说，冰晶体形成于切线方向。经测量，在两种冷却速度下，大多数冰孔半径方向上面积为100～350μm2，但是冷却速度为5℃/min的比25℃/min孔径稍长，样本的横断面积分别为400μm2和200μm2。冻干工艺为：以5℃/min的冷却速度，然后在-20℃真空干燥6h，接着在缓慢的加热过程中进行二次干燥，得到的冻干多孔叶片残余水分为8%～9%，内部孔的测量尺寸为100～350μm2。这对横断面积为150-200μm2的纤维原细胞提供了足够的通道。因此，在后来的所有研究中都采用了上述叶片冻干工艺。
SEM未能回答的问题：“内部冰孔与孔之间是互相连通，还是它们是独立封闭的？”为了回答这个问题，干燥前对叶片涂上荧光素，然后再用甲基安息香酸盐进行清洗后对它进行显微镜共焦扫描(CSM)，结果显示它的结构与开放的塑料泡沫相似。不过，SEM和CSM都暗示内部的多孔结构很少与表面联通。图5-28(a)和(b)显示了SEM的外观，流入表面上的凹陷很小(10~20μm),显得与内部的多孔结构不连通。CSM同样揭示了表面的口袋状结构，尽管横向连通的可能性不能被完全排除，但是它们似乎是封闭。
然而，当叶片被放置在玻璃皿上，大部分流人表面朝上，用1根8×20号手术针就可以创造出三角形的穿孔，直径尺寸为75~100μm[见图5-28(c)和(d)]，穿透了流出表面，孔径小于10μm。
ALAN的这项研究主要针对的是他提出的冻干瓣膜应具备的第一项功能：提供多孔结构，以便当使用瓣膜将其悬在介质中复水时，能允许纤维原细胞迅速进入瓣膜内部。
